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概述

细菌基因组测序 是指利用二代或三代测序技术,获得细菌的基因组序列;并在全基因组组装的基础上,进行基因组组分分析,功能注释等分析,其已取代传统方法成为研究细菌进化遗传机制,关键功能基因的重要工具。

产品方向

根据不同的研究目的和需求,细菌基因组测序可以细分为4个产品

细菌基因组de novo测序技术流程

细菌基因组重测序

样本要求

样本类型:基因组DNA

样本需求量:小片段文库≥2 μg ,2~3 kb大片段文库 ≥20 μg , 5~6 kb大片段文库 ≥20 μg ,10kb文库≥30 μg,20 kb和40 kb大片段文库 ≥ 60 μg

样本浓度:小片段文库≥30 ng/μL,大片段文库≥50 ng/μL

样本纯度:OD260/280=1.8~2.0

测序平台

细菌框架图/细菌精细图:HiSeq PE150

细菌完成图:PacBio RSⅡ

测序策略

细菌框架图:350bp文库≥100X

细菌精细图:350bp文库≥100X/6Kbp文库≥100X

细菌完成图:10Kb文库≥50X

案例1:

临床结核分支杆菌的比较基因组分析

Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates


研究材料

选取7株抗性范围不同的临床菌株。

研究策略

通过对7株抗性范围不同的临床菌株进行全基因组测序,然后与其他7株来源不同的菌株进行比较。

研究结果

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病的病原菌,特别是多重耐药和泛耐药结核分枝杆菌菌株的出现对结核病的防治产生了挑战。本文通过对7 株抗性范围不同的临床菌株进行了全基因组测序,并与其他7 株来源不同的菌株进行了比较。通过对抗性数据库注释发现了39 处耐药相关的变异,包括14 处先前报道过的位点以及25 处新的位点,并发现了主要抗原变异来源PE-PPE-PGRS 基因的16 处InDel。通过对SNP、InDel 及CRISPR 结构的查找和注释发现,多重耐药菌株和泛耐药菌株间在基因组水平上并没有显著的差异,表明临床结核分枝杆菌的耐药性进化过程是十分复杂而多变的。

参考文献

Liu F, Hu Y, Wang Q, et al. Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates [J].BMC genomics, 2014, 15(1): 469.

常见问题


Q 细菌基因组测序主要有哪些产品?

根据不同的研究目的与需求,细菌基因组测序可以细分为如下4个产品:

细菌框架图:采用DNA小片段(500bp)建库策略,利用MiSeq进行深度测序与初步的基因组组装,从而获得基因组序列信息,性价比高,满足细菌基因组研究基本需求。

细菌精细图:采用小片段(500bp)加大片段(2Kb+5Kb)建库策略,利用HiSeq与MiSeq进行深度测序与反复优化的基因组组装(Scaffold NO.≦50),是目前研究细菌基因组的主流产品。

细菌完成图:利用三代测序技术,根据菌株具体情况制定最优策略,最终得到一条完整的基因组序列(1 Scaffold,0 Gaps),是细菌基因组测序组装的最高要求。

细菌重测序:针对已知基因组序列的细菌,采用小片段建库,HiSeq深度测序,后续分析不依赖于组装,关注基因组变异情况(包括SNP与InDel等),是群体研究的首选。

Q DNA mate-pair文库(大片段文库)的定义、用途?

1、定义:首先将基因组DNA随机打断到特定大小(2-20kb);然后经末端修复,生物素标记和环化等实验步骤后,再把环化后的DNA分子打断成400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠将带有生物素标记的片段捕获。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成大片段文库,不需要克隆到细菌中,直接在Illumina测序仪上进行测序。通过大片段文库构建,从而获得基因组中较大跨度(2-20kb)片段两端的序列。

2、用途:DNA Mate-pair文库制备的整个过程需要5天,这种从较大跨度两端所获得的序列对基因组de novo项目的组装和基因组结构变异发掘具有非常重要的作用。

Q 群体进化分析,对于参考基因组选择有什么要求?

为研究多个菌株之间的进化顺序和起源关系,可以选择这些菌株之间的单拷贝核心基因作为遗传标记,构建进化树,并以此为基础进行地域传播、分歧时间、选择压力等相关研究。一般来说,选择的基因组间亲缘关系越远,单拷贝核心基因的数目也就越少。如果单拷贝核心基因的数目低于一定限度,如数百个基因以下,则进化树的精度会受到影响。以典型的应用场合为例,可以选择5株左右同一属的菌株,再额外选择2株左右临近属的菌株作为外群,总共5~8株菌株用于构建进化树。