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概述

宏基因组学 (Metagenomics),又称元基因组学,是以特定生境中的整个微生物群落作为研究对象,无需分离培养,直接提取环境样本DNA,采用新一代高通量测序技术,获得环境微生物基因信息总和,研究环境微生物的群落结构、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络等,已广泛应用于微生物领域。

涉及的研究热点

宏基因组测序技术流程

样本要求

常见环境样本(请使用干冰或冰袋运送)

土壤、淤泥、沉积物 ≥5 g ;粪便 ≥2 g ;组织样本≥1 g;水体送样为过滤后的滤膜(最适滤膜直径3-4 cm);拭子样本≥2个

DNA样本(请使用干冰或冰袋运送)

样本浓度≥50 ng/ μl,总量≥1.6 μg,OD260/280:1.8-2.0,无RNA、蛋白等污染。

技术参数

案例1:

肝硬化人群中肠道菌群的改变

Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis


研究材料

98例肝硬化患者和83例健康中国人志愿者粪便样本,采用宏基因组学研究方法,建立肝硬化菌群基因集。

研究结果

测序共得到858G数据,人均4.74G,建立了肝硬化肠道菌群基因集。发现了 28 种细菌与肝硬化密切相关,其中多个细菌是肝硬化患者中首次发现,38 种与健康人密切相关,可以作为肝硬化的生物标记物。本研究发现了13,970 个NOG 功能分类与疾病相关,其中肝硬化特异同源的基因主要为膜转运相关基因,这与II 型糖尿病的基因类似,健康菌群的基因则多与糖代谢、氨基酸代谢、维生素代谢、能量代谢和信号转导等同源。

参考文献

Qin N, Yang F, Li A, et al. Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis [J]. Nature, 2014, 513(7516): 59-64.

案例2:

囊性纤维化中的痰DNA测序:非侵入性地获取肺微生物组和病原体详细资料

Sputum DNA sequencing in cystic fibrosis: non-invasive access to the lung microbiome and to pathogen details.


研究材料

 选取6个囊性纤维化患者和11个对照样品(包括健康受试者和慢性阻塞性肺疾病患者)的痰液。

研究策略

 对6个囊性纤维化患者和11个对照样品的痰液进行宏基因组测序。

研究结果

获得迄今为止对囊性纤维化呼吸道微生物最无偏和全面的信息, 确认囊性纤维化肺一致地表现出减少的微生物多样性。痰宏基因组学提供了肺病原体微生物组的深入剖析,可以推导出优势病原体的包括抗生素抗性在内的功能和分类特征,为准确、非侵入性的临床诊断提供支持。

图1. 痰宏基因组学工作流程

图2. 抗生素抗性和其它表型预测

参考文献

Feigelman B., Kahlert C.R. , Baty F., et al. Sputum DNA sequencing in cystic fibrosis: non-invasive access to the lung microbiome and to pathogen details.(2017).Microbiome, 5(1):20.

常见问题


Q 土壤样品制备注意事项?

采样时,去除表面浮土,使用乙醇火烧的铲子挖取地下5~20厘米的土层,去除可见根后,土壤过2毫米筛网,每个样品从3个采样点采集并混合而成,其中样品量为5g,将采集的土壤样品保存于无菌离心管中,置于0℃以下,待样品采集完毕后,运回实验室,用于抽提DNA,如不能马上实验,请将土壤样品迅速冻存于-20℃冰箱。

Q 粪便样品制备注意事项

粪便的保存,可放在-80℃,根据经验,取内部粪便提取基因组最好,但是不易操作。由于粪便自身的特殊性,建议随时收集随时保存,以便达到最优的DNA提取效果。

Q 对于宏基因组项目,怎么排除宿主污染?

1、取样时,尽量不要取靠近组织的部位。

2、提取的时候采用相应的试剂盒。

3、若有参考基因组,可通过比对分析去除宿主基因组污染。

Q 如果存在较大的宿主的污染,且没有宿主基因组的参考序列可以进行宏基因组测序吗?

不可以,如果宿主的DNA包含大量的环境DNA,测序之后,会存在严重的污染,暂无已知宿主基因组的序列来进行比对去污染,会影响后续结果分析的准确性,且可用的数据量会很少;但是如果在提取的过程,宿主基因组的污染的量较少,后期的数据分析暂可忽略污染。

Q 为什么进行混合组装?

首先,根据单样品多k-mer进行组装,选取最适Scaffolds,将质控后的Clean data比对至各样品Scaftigs,获取各样品未被利用的PE reads混合后组装。这样既充分利用数据,又能挖掘低丰度物种信息。

Q 做Meta 分析需要有生物学重复吗?

最好有5个或5个以上的生物学重复,人和动物样本因个体特异性较大,建议10个以上生物学重复。

Q 我们的宏基因组组装有组装指标吗?某些菌是否能够组装到基因组的20%?

我们的宏基因组没有组装指标,因为宏基因组的组装结果与样品情况有关,目前我们肠道样品宏基因组组装N50可以达到1K以上。