圣庭生物-ShengTingGroup

概述

转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带。真核mRNA测序是基于HiSeq平台,对真核生物特定组织或细胞在某个时期转录出来的所有mRNA进行测序。既可研究已知基因,亦能发掘新基因,全面快速获得mRNA序列和丰度信息。还用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。转录组研究已经成为揭示生物生长发育调控、逆境胁迫和抗病反应机制的最佳研究手段。真核mRNA测序方法可分为:有参考转录组、无参考转录组及数字基因表达谱(DGE)三大类。

应用

1、环境转录组学;2、发育转录组;3、遗传转录组;4、比较转录组;5、互做转录组学。

技术流程

样本要求

样本类型:去蛋白并经过Dnase处理的总RNA;

RNA样本量:≥5.0 μg

RNA浓度: ≥200 ng/μL

RNA纯度: OD260/280=1.8-2.2,OD260/230 ≥2.0;

动物样本:RIN ≥7.0,植物样本:RIN ≥6.5,28S:18S ≥1.0

策略

案例1:

采用RNA测序的方法在乳羊转录组中发现变异

Variant discovery in the sheep milk transcriptome using RNA sequencing.


研究材料

八只西班牙常见乳羊—Churra和Assaf羊的体细胞。

研究策略

对上述样本进行高通量转录组测序(RNA-Seq)。

研究结果

检测到总共216,637个变体,其中,在含有产奶量,蛋白质百分比和脂肪百分比的数量性状基因座(QTL)的区域中检测到总共57,795个变体,其中21.44%是新变体。分别在编码主要乳蛋白和参与脂质代谢的分子的基因中鉴定了总共504个和1063个变体。在这些变体中,发现20个突变对编码的蛋白质可能具有相关作用。本研究中发现的几个SNP可以作为基因分型平台或定制SNP阵列的合适的标记,从而在具有经济价值的动物中进行关联分析。

图1. 全基因组变异密度

图2. 采用SnpEff和VEP软件对本研究鉴定的新突变进行功能分析

参考文献

Suárez-Vega A., Gutiérrez-Gil B., Klopp C., et al. Variant discovery in the sheep milk transcriptome using RNA sequencing. BMC Genomics, 2017, 18(1):170. 

常见问题


Q 转录组测序的技术重复性很高,那是否还有必要设生物学重复?

有必要,至少需要两次生物学重复,3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。

Q 转录组测序详细的样本要求是怎样的?

合格 不合格(建库有风险)
RNA 1. OD260/280≧1.8
2. 28S/18S≧1
(植物参考25S/18S;原核参考23S/16S;特殊样品只有18S可不参考)
真核:总量≧1μg(单次建库),浓度≧50ng/μl
原核:总量≧3μg(单次建库),浓度≧65ng/μl
植物、真菌 RIN值≧6.5
动物 RIN值≧7.0
原核 RIN值≧6.0
(特殊物种,如没有28S,可以不参考,但Agilent 2100 图的基线要平整,RIN值最好可以达到7.0)
N/A
真核:总量 <1μg
原核:总量 <3μg
RIN值 <7.0
注:1、如果样品OD值未达到要求:可能影响转录组建库时磁珠分离mRNA及反转录效率;可能对基因定量和文库随机性有轻微影响,导致duplication比例高。        2、基因组注释:基因预测、功能基因注释(与Nt、Nr、Swiss-Prot、Interpro等数据进行同源比对)、重复序列分析及Non-coding RNA注释等。        3、基因功能分析:包括GO富集分析、KEGG通路分析等。        4、比较基因组学及进化分析:通过比较相近物种的基因组数据,从基因功能、基因组骨架结构、分子进化等方面对目标物种基因组进行深入分析)。